DELPHANTO

Окислительный стресс при увеите и его коррекция антиоксидантным ферментом супероксиддисмутазой (экспериментальное исследование)

Чеснокова Н.Б.1, Нероев В.В. 1, Безнос О.В.1, Бейшенова Г.А.1, Никольская И.И.2, Кост О.А.2, Биневский П.В.2, Шехтер А.Б.3 ВЕСТНИК ОФТАЛЬМОЛОГИИ 2014, №5

1 ФГБУ «МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России, ул. Садовая-Черногрязская, 14/19, Москва, Российская Федерация, 105062;

2 Кафедра химической энзимологии химического факультета ФГБОУ ВПО «МГУ им. М.В. Ломоносова», Ленинские горы, 1, стр. 3, МГУ, химический факультет, Москва, Российская Федерация, 119991;

3 Лаборатория экспериментальной патоморфологии ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», ул. Трубецкая, 8, Москва, Российская Федерация, 119992

Цель — изучить влияние острого экспериментального увеита на биохимические показатели влаги передней камеры, характеризующие интенсивность воспаления, состояние местной антиоксидантной и антипротеолитической систем; Исследовать действие инстилляций супероксиддисмутазы (СОД) на характер клинического течения и локальные метаболические процессы при увеите.

Материал и методы. У кроликов моделировали острый увеит путем введения нормальной лошадиной сыворотки подкожно и интравитреально, в водянистой влаге определяли концентрацию белка, антиокислительную активность, активность СОД, α2-макроглобулина, суммарное содержание продуктов обмена монооксида азота, количество лейкоцитов. Проводили клиническую оценку течения увеита и гистологическое исследование.

Результаты. Обнаружено, что при увеите происходит достоверное повышение содержания в водянистой влаге белка, лейкоцитов, активности СОД и α2-макроглобулина и снижение антиокислительной активности в отношении гидроксильного радикала. Инстилляции СОД способствовали снижению перечисленных показателей и повышению антиокислительной активности, а также улучшению клинического течения увеита. Заключение. Купирование окислительного стресса, развивающегося при увеите, с помощью инстилляций СОД способствует улучшению клинического течения заболевания, что подтверждено биохимическими исследованиями.

Ключевые слова: увеит, окислительный стресс, супероксиддисмутаза, водянистая влага, антиокислительная активность.

Oxidative stress in uveitis and its correction with superoxide dismutase antioxidative enzyme (experimental study)

Writers: N.B. Chesnokova1, V.V. Neroev1, O.V. Beznos1, G.A. Beyshenova1, I.I. Nikol'skaya2, O.A. Kost2, P.V. Binevski2, A.B. Shekhter3

1 Moscow Helmholtz Research Institute of Eye Diseases, Ministry of Health of the Russian Federation, 14/19 Sadovaya-Chernogryazskaya St., Moscow, Russian Federation, 105062;

2 Lomonosov Moscow State University, Faculty of Chemistry, Department of Chemical Enzymology, 1-3 Leninskie Gory, Moscow, Russian Federation, 119991;

3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ophthalmology Department, 8-2 Trubetskaya St., Moscow, Russian Federation, 119992

Objective — to study the influence of experimental uveitis on those biochemical parameters of aqueous humor that reflect inflammation acuity as well as local antioxidant and local antiproteolytic activity; to study the effect of topical superoxide dismutase (SOD) on the clinical course of uveitis and ocular metabolism.

Material and methods. Acute uveitis was induced in rabbits by a double injection (subcutaneous and intravitreal) of normal horse serum. The following parameters of aqueous humor were measured: protein concentration, antioxidant activity, SOD activity, α2-macroglobulin level, total nitrates and nitrites, and leukocyte number. Clinical assessment and histopathological study were performed.

Results. It was found that uveitis is associated with a statistically significant increase in protein concentration, leukocyte number, SOD activity, and α2-macroglobulin level in aqueous humor as well as a decrease in anti-hydroxyl radical activity. SOD instillations contributed to the reduction of the listed parameters and improvement of the antioxidant activity. Clinical presentations of uveitis also became less pronounced.

Conclusion. SOD instillations for oxidative stress correction help reduce clinical presentations of uveitis, which is confirmed by biochemical examination.

Keywords: uveitis, oxidative stress, superoxide dismutase, aqueous humor, antioxidant activity.

ССГ на фоне системной вирусной инфекции

При увеитах различной этиологии происходит увеличение содержания в тканях цито- и хемокинов, которые способствуют образованию свободных радикалов1. Увеличение количества свободных радикалов приводит к активации факторов транскрипции, в том числе NF-κВ, в результате чего увеличивается синтез медиаторов воспаления2. Факторы воспаления провоцируют дальнейшее увеличение количества свободных радикалов, что приводит к образованию порочного круга, развитию окислительного стресса и неконтролируемому усилению воспаления. Выявлена корреляция между тяжестью течения увеита и истощением антиоксидантных резервов глаза3.

Контроль уровня супероксид-аниона — основного фактора, запускающего окислительный стресс, осуществляют изоферменты супероксиддисмутазы (СОД), которые присутствуют в местах образования этого радикала: в митохондриях, микросомах, цитозоле, а также в межклеточном матриксе. СОД дисмутирует супероксид-анион до перекиси водорода, которая далее инактивируется каталазой.

В ответ на развитие окислительного стресса повышается активность СОД, но уровня эндогенного фермента может быть недостаточно, тем более что СОД может инактивироваться в результате нитрования ее образующимся при окислительном стрессе пероксинитритом4. 5.

Цель исследования — при экспериментальном увеите изучить изменение биохимических показателей во влаге передней камеры, отражающих интенсивность окислительного стресса и воспаления; оценить действие антиоксидантного фермента СОД при местном применении в виде глазных капель на характер клинического течения и локальные метаболические процессы при экспериментальном увеите у кроликов.

Материал и методы

Работа выполнена на 25 кроликах (50 глаз) породы шиншилла массой 2,0—2,5 кг. У 22 животных воспроизводили увеит путем двукратного введения нормальной лошадиной сыворотки: 1-ю дозу (5 мл) вводили подкожно, 2-ю (0,07 мл) — интравитреально на 10-е сутки после 1-й6. Три здоровых кролика (6 глаз) были взяты для контроля биохимических показателей.

Для лечения использовали препарат Рексод (ООО «НПП Ферментные технологии», Россия), представляющий собой рекомбинантную СОД человека.

Кролики с увеитом были разделены на две группы по 11 животных. Кроликам 1-й группы ежедневно в течение 7 дней, начиная со дня введения разрешающей дозы, проводили инстилляции раствора СОД 3 раза в день по 0,03 мл в оба глаза, 2-й группы — инстилляции плацебо (буферный раствор pH 7,4).

Клиническую оценку течения увеита проводили ежедневно путем биомикроскопии с помощью щелевой лампы. В условных баллах по принятой в лаборатории шкале оценивали выраженность следующих признаков: отек и гиперемия век, бульбарной конъюнктивы и радужки, отек роговицы, вид экссудата и количество фибрина в передней камере глаза, наличие задних синехий, помутнение хрусталика.

На 4-е и 8-е сутки увеита у 4 кроликов (8 глаз) из каждой группы отбирали из каждого глаза около 0,15 мл влаги передней камеры и выводили животных из эксперимента. Водянистую влагу центрифугировали и супернатант использовали для исследований.

Определяли следующие показатели: концентрацию общего белка по Лоури7; антиокислительную активность в отношении гидроксильных радикалов (АОА-ОН•) и супероксид-анион-радикала (АОА-О2 •–) по параметрам кинетики хемилюминесценции в модельной системе Hb—H2O2—люминол8; активность СОД по торможению автоокисления кверцетина9; уровень α2-макроглобулина (α2-МГ) ферментативным методом по ингибированию активности трипсина10; суммарное содержание продуктов обмена монооксида азота (NO) — нитратов и нитритов с использованием реагента Грисса11. Проводили подсчет лейкоцитов в водянистой влаге.

Величину оптической плотности образцов измеряли на микропланшетном фотометре Synergy MX («Bio-Tek», США). Кинетику хемилюминесценции регистрировали на хемилюминометре Биотокс-7 (НПО «Энергия»). Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов программ Excel и Statistica.

На 4-е сутки у трех кроликов (6 глаз) из каждой группы энуклеировали оба глаза и провели их гистологическое исследование. Микротомные срезы толщиной 4—5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Анализ препаратов проводили с использованием светового микроскопа Olympus BX51 с цифровой видеокамерой SDU («Спецтелетехника», Россия).

Результаты и обсуждение

У кроликов с увеитом без лечения на 4-е сутки течения увеита содержание белка в водянистой влаге возрастало в 40 раз по сравнению с нормой (см. таблицу), что является следствием увеличения проницаемости сосудов радужки и цилиарного тела.

Во влаге передней камеры в большом количестве обнаруживались лейкоциты. Развивающееся воспаление и активная миграция лейкоцитов приводят к массивному выбросу активных форм кислорода1, поэтому закономерно, что антиокислительная активность водянистой влаги по отношению к гидроксильному радикалу в острую фазу увеита значительно снижалась (до 20% от нормы) вследствие расходования эндогенных антиоксидантов на нейтрализацию высокотоксичных гидроксильных радикалов.

В то же время антиокислительная активность водянистой влаги по отношению к супероксид-анион-радикалу возрастала, по-видимому, за счет выявленного нами повышения активности СОД на 164%. Увеличение активности СОД является компенсаторной реакцией на усиление свободнорадикальных процессов и характерно для развития окислительного стресса5.

Возрастало и содержание продуктов метаболизма NO, что связано с усилением его продукции при воспалении. Одновременное наличие в тканях большого количества супероксиданион-радикала и радикала NO создает условия для образования высокотоксичного радикала пероксинитрита, который способен нитровать различные функциональные и структурные белки, в том числе СОД, с потерей их свойств4. 5. Показана и способность пероксинитрита вызывать структурные изменения в эндотелиальном слое роговицы12. 13.

Биохимические показатели во влаге передней камеры кроликов на 4-е и 7-е сутки увеита (в % от такового у здоровых животных)

Биохимические показатели во влаге передней камеры кроликов на 4-е и 7-е сутки увеита

Рис. 1. Биохимические показатели во влаге передней камеры кроликов на 4-е и 7-е сутки увеита (в % от таковых у животных, получавших плацебо).

Биохимические показатели во влаге передней камеры кроликов на 4-е и 7-е сутки увеита

В острый период увеита в водянистой влаге значительно увеличивалась активность ингибитора протеаз α2-МГ, что можно объяснить усилением его местного синтеза клетками воспалительного инфильтрата, в частности макрофагами. Повышение активности α2-МГ характерно для процессов, затрагивающих иммунную систему, поскольку помимо ингибирования протеаз этот белок выполняет роль переносчика ряда цитокинов и антител, а также супрессивного медиатора иммунной системы14.

У кроликов, получавших инстилляции СОД, во влаге передней камеры было значительно меньше лейкоцитов (рис. 1), ниже уровень α2-МГ (особенно на 7-е сутки), ниже содержание белка, что свидетельствует о менее выраженном воспалении. Антиокислительная активность по отношению к гидроксильному радикалу, напротив, оказалась на 40% выше, чем у животных, получавших плацебо, т.е. СОД способствовала увеличению антиокислительного потенциала и подавлению окислительного стресса.

На 7-е сутки течения увеита отмечалось повышение антиокислительной активности и снижение всех остальных показателей, что характерно для уменьшения интенсивности воспалительного процесса.

У нелеченных животных в течение всего периода наблюдения признаки увеита были ярко выражены: конъюнктива отечна и гиперемирована, развивался прогрессирующий отек роговицы, отек и гиперемия радужки, во влаге передней камеры в большом количестве обнаруживался фибрин, формировались задние синехии, в большинстве случаев круговые, хрусталик становился диффузно мутным, стекловидное тело сквозь него не визуализировалось, позже во всех глазах развилась катаракта. На 6—7-е сутки пальпаторно определялось повышение внутриглазного давления, что свидетельствует о развитии вторичной гипертензии. У животных, получавших инстилляции раствора СОД, клиническая картина заметно отличалась.

Признаки конъюнктивита были выражены незначительно (р<0,05 по сравнению с нелеченными животными), перикорнеальная инъекция конъюнктивы — умеренно. Отек роговицы был локальным, нерезко выраженным и со временем уменьшался, как и отек радужки. Количество фибрина в передней камере было достоверно меньше (р<0,05). Во время лечения отмечались регресс задних синехий и частичное восстановление реакции зрачка на свет. Помутнение хрусталика было незначительным.

Гистологическое исследование показало, что у животных, не подвергавшихся лечению, развился выраженный панувеит. У всех животных отмечались резкое утолщение, отек и плотная нейтрофильная инфильтрация сосудистой оболочки во всех отделах глаза и отложение на ней фибринозно-гнойного экссудата. Отек и инфильтрация распространялись на ткань цилиарного тела, склеру и сетчатку. Имелась частичная деструкция пигментного эпителия сосудистой оболочки и эпителия цилиарных отростков. В роговице отмечались разрыхление коллагенового каркаса, очаговая деструкция десцеметовой мембраны и десквамация эндотелия (рис. 2), характерные для увеита15. В группе, получавшей инстилляции СОД, выраженность увеита была существенно меньше. Отсутствовал фибринозно-гнойный экссудат в полости глаза, сосудистая оболочка оставалась тонкой, и лишь в отдельных участках радужки и цилиарного тела отмечались отек и воспалительная инфильтрация. Эпителий роговицы не изменен, эндотелий десквамирован местами, изменения десцеметовой мембраны и стромы минимальны.

Рис. 2. Гистологический срез роговицы кроликов на 4-е сутки экспериментального увеита

а — инстилляции плацебо; отек и разволокнение коллагеновых волокон роговицы, десквамация эндотелия, частичная деструкция десцеметовой мембраны; б — инстилляции СОД; умеренное разрыхление коллагеновых волокон роговицы, частичная десквамация эндотелия, клеточная инфильтрация отсутствует, изменения десцеметовой мембраны минимальны. Окраска гематоксилином и эозином. ×100.

Гистологический срез роговицы кроликов на 4-е сутки экспериментального увеита

Заключение

Развитие увеита сопровождается значительными изменениями активности локальных антиокислительной, антипротеолитической систем и продукции NO. Применение антиоксидантного фермента СОД способствует нормализации биохимических показателей во влаге передней камеры и существенно улучшает клиническое течение экспериментального увеита.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.Н., Н.Ч., О.К.

Сбор и обработка материала: О.Б., Г.Б., А.Ш., П.Б.

Статистическая обработка данных: О.Б.

Написание текста: О.Б.

Редактирование: Н.Ч., И.Н., О.К.

Конфликт интересов отсутствует.

Список литературы

1. Yadav U.C.S., Kalarya N.M., Ramana K.V. Emerging role of antioxidants in the protection of uveitis complications. Curr. Med. Chem. 2011; 18 (6): 931—942.

2. Gloire G., Legrand-Poels S., Piette J. NF-kappaB activation by reactive oxygen species. Biochem. Pharmacol. 2006; 72: 1493—1505.

3. Катаргина Л.А., Сидорова Т.В., Чеснокова Н.Б, Кузнецова Т.П. Клиническое значение антиокислительной активности сыворотки крови и слезной жидкости при эндогенных увеитах у детей. Вестник офтальмологии. 2003; 2: 20—21.

4. Aslan M., Yucel I., Ciftcioglu A., Savas B., Akar Y., Yucel G., Sanlioglu S. Corneal protein nitration in experimental uveitis. Exp. Biol. Med. 2007; 232: 1308—1313.

5. Pittman K.M., MacMillan-Crow L.A., Peters B.P., Allen J.B. Nitration of manganese superoxide dismutase during ocular inflammation. Exp. Eye Res. 2002; 74 (4): 463—471.

6. Нероев В.В., Давыдова Г.А., Перова Т.С. Моделирование иммуногенного увеита у кроликов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006; 142 (11): 598—600.

7. Lowry O., Rozebrough N., Farr A., Randell R. Protein mеasurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265—275.

8. Гулидова О.В., Любицкий О.Б., Клебанов Г.И., Чеснокова Н.Б. Изменение антиокислительной активности слезной жидкости при экспериментальной ожоговой болезни глаз. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1999; 128 (11): 571—574.

9. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина. Вопросы медицинской химии. 1990; 2: 88—91.

10. Чеснокова Н.Б., Кузнецова Т.П. Исследование суммарной активности трипсиноподобных протеиназ и антипротеолитической активности в слезной жидкости при воспалительных заболеваниях глаз для выбора рациональной терапии: Методические рекомендации. М.: Минздравмедпром РФ; 1995. 10 с.

11. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluid. Ann. Biochem. 1982; 126: 131—138.

12. Behndig A., Karlsson K., Brannstrom T., Sentman M.-L., Marklund S.L. Corneal endothelial integrity in mice lacking extracellular superoxide dismutase. Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 2001; 42 (12): 2784—2788.

13. Yanagiva N., Akiba J., Kado M., Hikichi T., Yoshida A. Effect of peroxynitrite on rabbit cornea. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 2000; 238 (7): 584—588.

14. Мальцева Н.В., Львова О.Ф., Конишева Т.В., Зорина Р.М., Архипова С.В., Чирикова Т.С., Зорин Н.А. Иммунорегуляторные свойства альфа-2-макроглобулина. Rus. J. Immunol. 1996; 1 (1): 55—60.

15. Катаргина Л.А., Шестова Ю.П., Денисова Е.В. Структурные изменения роговицы при эндогенных увеитах у детей по данным конфокальной микроскопии. Российский офтальмологический журнал. 2012; 5 (4): 37—42.

DELPHANTO®

Естественное увлажнение «сухого глаза»

Где купить?